大鼠脑出血模型中血脑屏障开放规律及应用脑

摘自：《中西医结合心脑血管病杂志》年7月第14卷第14期

作者：张亚红、刘重霄、周任、师蔚、郭振宇

单位：西安医院

摘要

目的在建立大鼠脑出血（ICH）模型基础上，通过观察血脑屏障（BBB）开放规律及早期应用药物进行干预，探讨ICH后脑损伤的致病机制及治疗方案。方法选用SD大鼠78只，随机分为ICH组、治疗组和对照组，各组又随机分为1h、6h、1d、3d、７ｄ和14ｄ亚组，ICH组、治疗组注射Ⅳ型胶原酶建立ICH模型，造模后进行脑含水量及伊文氏兰含量测定。结果ICH组：脑出血后早期（1h）即有脑水肿出现，6h至3d脑水肿增加明显，7d后渐下降；治疗组：脑水肿于3d左右开始明显增加，7d后下降。脑出血后BBB变化:1h脑出血组和治疗组即有伊文氏兰渗出，ICH组分别造模后6h和3d达到高峰；治疗组于造模后6h到达高峰。结论脑血疏口服液可以通过抑制BBB的开放，减轻脑水肿的发生、发展，从而减轻ICH后脑损伤。

关键词：脑出血；脑水肿；脑血疏口服液；血脑屏障；中风中图分类号：RR.5文献标识码：Adoi：10./j.issn.-..14.文章编号：-（）14--03

脑出血（ICH）后脑内血肿及其分解产物可引起脑组织继发损伤，并产生一系列病理生理改变。研究表明：脑出血早期即有血脑屏障（BBB）破坏并伴有血管源性脑水肿等继发性脑损伤发生，而且随着BBB的破坏及通透性增加，血液成分及其降解产物和炎性细胞大量渗入脑组织中，导致神经元凋亡和脑组织进一步损伤。那么ICH后BBB破坏具体时程如何，目前研究结果仍未有定论，故如何早期对BBB进行干预，是国内外神经科学领域关心的热点。近年的研究表明：脑血疏口服液具有益气、活血、化瘀之功效，临床应用发现其确实对ICH病人颅内血肿吸收起到促进作用，但其确切治疗机制仍未完全明了。本实验拟在建立大鼠ICH模型基础上，观察BBB开放规律及早期应用脑血疏口服液进行干预的效果，ICH后脑损伤的致病机制及治疗方案。

1.材料与方法

1.1动物分组

健康清洁SD大鼠78只，体重-g，雄性，由西安交通大学动物实验中心提供。实验动物使用随机数字表法分为：ICH组、治疗组和对照组。ICH组和治疗组再随机分为1h、6h、1d、3d、7d和14d亚组，每亚组6只动物，对照组共6只动物，各组间动物体重无明显差异。

1.2ICH动物模型建立

用Ⅳ型胶原酶建立ICH模型，大鼠术前12h禁饮食4h禁水，0.4％戊巴比妥钠腹腔麻醉（40mg/Kg），必要时水合氯醛补充麻醉，保证手术操作期间大鼠有自主呼吸，俯卧位固定于动物头颅立体定向仪上，头皮“钉子型”剪开，取前囟为原点，向右3mm，向后1mm，深度5mm为注射点（尾状核），磨钻磨开颅骨，进针后缓慢注射Ⅳ型胶原酶、肝素和生理盐水混合溶液（每1微升含Ⅳ型胶原酶0.2单位及肝素2单位），留针10min，缓慢退针，骨蜡封闭颅骨钻孔，缝合头皮。术中注意大鼠呼吸情况并保持呼吸道通畅，大鼠体温控制在36.5-37.5℃，术毕动物送入有空调的动物房饲养。对照组组按Ⅳ型胶原酶法注入相同剂量生理盐水；治疗组按上述造模方法每8小时灌服脑血疏口服液1ml/Kg，ICH组及对照组灌服生理盐水。

1.3脑组织含水量测定（干湿重法）

术后在相应时间点用过量的水合氯醛麻醉动物，迅速开胸暴露心脏，从左心室插管至主动脉根部，在右心耳剪开一小口当作出口。4％多聚甲醛ml快速灌注，之后稍减慢灌注速度继续固定，灌注约30分钟至动物四肢变硬，断头取脑，测湿重标本，取ICH侧皮质针孔前组织，厚约3mm脑组织测定湿重，然后将标本放于95℃烘箱中烘干24小时再称重，干湿重均由电子分析天平称量。脑组织含水量按如下公式计算：脑组织含水量＝（湿重-干重）/湿重×％，干湿重均精确到0.1mg。

1.4伊文氏兰注射及标本采集

对照组注射2％伊文氏兰3ml/kg后24小时处死，ICH组和治疗组于造模前1小时注射等量的伊文氏兰。取脑前，用生理盐水左心室灌注至右心耳流出清亮液体。横断面切取损伤平面厚约3mm的脑组织，将其分为ICH侧皮质、皮质下和建侧皮质、皮质下4个部分，分析天平上称量其湿重，将各部分放入匀浆器匀浆，匀浆液为2ml的50％三氯乙酸（TCA），充分匀浆后，将组织匀浆液rpm离心20min，在伊文氏兰最大吸收光谱nm处检测吸光度，从伊文氏绘制标准曲线上查得伊文氏兰含量结果以ug/g脑组织表示。

1.5统计学处理

所有实验剂量数据均以±s表示，采用SPSS13.0软件包分析。组间比较进行两因素方差分析，P＜0.05有显著性差异。

2结果

2.1ICH后大鼠脑组织含水量变化规律

ICH组在造模后1小时即有脑组织含水量增加，但此时与治疗组和对照组之间无显著性差别(P＞0.05)；6h时ICH组脑含水量较治疗组和对照组增加明显，并有统计学意义(P＜0.05)，但治疗组与对照组之间的差别无显著性(P＞0.05)；3d时ICH组含水量达到高峰，与治疗组和对照组之间的差别有显著性(P＜0.05)，并且此时治疗组和对照组相比亦有显著性差别(P＜0.05)；7d时ICH组脑含水量仍高于对照组和治疗组(P＜0.05)，但治疗组和对照之间差别无显著性(P＞0.05)；14d时ICH组与治疗组和对照组之间差别均无统计学意义（P＞0.05）。

2.2ICH后大鼠脑组织伊文氏兰变化规律

ICH后1h脑出血组和治疗组即有伊文氏兰渗出，ICH组分别造模后6h和3d达到高峰；治疗组于造模后6h到达高峰。

3.讨论

脑出血（ICH）是严重危害人类健康的常见病和多发病，ICH后继发性脑损伤是导致ICH患者致残率和死亡率极高的重要原因之一。目前关于ICH后脑损伤的研究认为损伤原因包括两方面：一是原发性脑损伤或称直接脑损伤，其损伤机制为ICH后神经元胞体受到挤压，轴突遭受撕扯、断裂，及ICH后神经细胞在营养摄取方面障碍，从而导致相应的脑损伤；二是继发性脑损伤或称间接脑损伤，其损伤机制包括血肿腔及周围急性炎性反应、血细胞的渗出及局部或全身免疫细胞的激活，并释放大量的有害因子（如免疫因子、血红蛋白）造成的脑损伤，同时有血脑屏障BBB的破坏及脑水肿、脑肿胀的形成，最终引起脑疝致患者死亡。有关继发性脑损伤的研究证实：ICH后红细胞成分血红蛋白被释放到脑组织或蛛网膜下腔中，其在代谢过程中产生脂质过氧化反应导致了神经元细胞膜损伤、DNA片断化和细胞凋亡。目前研究认为继发性脑损伤在ICH后脑损伤中占有主导地位，而BBB的破坏又是继发性脑损伤的中心环节。

现阶段对BBB开放规律及时间还尚未定论：Hartl等人在研究动物脑皮质损伤（corticalcontusioninjury,CCI）后认为：BBB开放存在两个高峰，BBB于脑损伤后1小时左右首次开放，于24小时达到第一次高峰，其后渐下降。第二次开放高峰形成于伤后第3天；Baskaya等在研究脑外伤（traumaticbraininjury,TBI）后提出：脑损伤后BBB两次开放高峰分别形成于4-6小时和72小时，并且两次BBB开放与外伤后原发和继发性脑损伤是相对应的，他认为脑外伤可以直接导致BBB破坏即第一次开放高峰的到来，而第一次BBB开放高峰不仅使血细胞外渗，而且还有很多炎性因子也随之渗出，这样为炎性因子再次破坏BBB内皮细胞提供了前提，也为第二次BBB开放作了准备。本次实验通过观察大鼠ICH后脑组织含水量及检测鼠脑组织中伊文氏兰含量得出了与TBI后BBB开放规律类似的结论：ICH后早期（1-6h）即有BBB开放并有脑水肿发生，至ICH后3d左右BBB再次开放，同时到达水肿最高峰，7d后水肿缓慢下降，14d后基本恢复对照组水平（见图1-2）。

脑血疏口服液具有“益气、活血、化瘀”的作用，其主要成分为黄芪、水蛭、石菖蒲、牛膝及川芎，主要用于“气虚血瘀”所致中风患者。近年来,脑血疏口服液广泛应用于出血性脑血管病的治疗，疗效肯定。年谢道珍等[3]研究结果显示，将脑血疏口服液用于出血脑中风患者后，其治疗组总有效率高达87.74%。鲁明等采用脑血疏口服液治疗高血压性脑出血，结果显示其治疗组总有效率为95.7%，明显高于对照组。本次实验中，治疗组应用脑血疏口服液进行干预后，BBB开放起始时间较ICH组延后，并且脑水肿程度明显降低（见图1-2）。现在对BBB相关研究较多集中在其破坏方式上，主要有两种：其一是毛细血管内皮细胞损伤即细胞的坏死或凋亡；其二是细胞间紧密联结的破坏。那么脑血疏口服液是通过何种渠道对BBB进行保护，这还需进一步研究证实。

综上所述，脑血疏口服液可以减轻ICH后脑损伤的可能机制为：通过抑制BBB的开放，减轻脑水肿的发生、发展，从而达到改善神经功能的目的。

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